Молекулярная генетика

Разведение стандартов кПЦР

Считает, сколько стока плазмиды и растворителя взять для заданного числа копий. Если стока нужно меньше 3 мкл, подбирает промежуточное разведение.

Параметры стандарта

Как приготовить

1 × 10⁸ копий/мкл Целевые копии

Прямое разведение потребовало бы 0,11 мкл — меньше 3 мкл. На таких объёмах ошибка дозатора очень велика, поэтому нужно промежуточное разведение.

Промежуточное разведение
  1. Шаг 1. Промежуточное разведениеРазведение 1:33,3

    Взять стока: 3 мкл

    Добавить растворителя: 97 мкл

    Довести до: 100 мкл

    Получится: 30 нг/мкл ≈ 5,475 × 10⁹ копий/мкл

  2. Шаг 2. Рабочий растворРазведение 1:54,7

    Взять промежуточного раствора: 3,65 мкл

    Добавить растворителя: 196,35 мкл

    Довести до: 200 мкл

    Получится: 0,548 нг/мкл ≈ 1 × 10⁸ копий/мкл

Советы

  • Перед взятием стока перемешайте его вортексом или пипетированием: плазмида оседает, и концентрация у стенок отличается.
  • После каждого разведения сбросьте капли, перемешайте 10–15 раз пипетированием или вортексом и снова сбросьте капли.
  • Для разведённых стандартов берите низкосорбционные пробирки: на обычном пластике теряются единицы копий. Альтернатива — буфер для разведения с salmon sperm DNA, например 2 нг/мкл.
  • Храните разведения аликвотами и размораживайте один раз. В буфере для разведения производитель допускает 2–8 °C не менее недели; при −20 °C опубликованы данные о стабильности стандарта до 8 недель. Точный срок зависит от матрицы и буфера.

История стандартов

Хранятся последние 10 расчётов в этом браузере. На сервер ничего не отправляется.